細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法在腫瘤研究中的應(yīng)用
細(xì)胞凋亡的細(xì)胞化學(xué)測(cè)定
細(xì)胞凋亡的細(xì)胞化學(xué)測(cè)定包括細(xì)胞表面（細(xì)胞膜）的結(jié)構(gòu)和通透性改變的測(cè)定和細(xì)胞核DNA改變的測(cè)定。根據(jù)應(yīng)用的范圍，又可分為細(xì)胞群休和單個(gè)細(xì)胞測(cè)定兩種，以下僅介紹其中幾種較為常用的方法。
碘化丙啶（propidium iodide,PI）檢測(cè)
早期死亡細(xì)胞膜通透性狀態(tài)的不同是區(qū)分細(xì)胞凋亡和壞死的一個(gè)重要指標(biāo)，凋亡細(xì)胞在進(jìn)入zui終溶解階段前，胞膜通透性無(wú)明顯改變，相對(duì)分子質(zhì)量大的與DNA結(jié)合的熒光染料（如PI）不能時(shí)入凋亡細(xì)胞內(nèi)，而相對(duì)分子質(zhì)量小的熒光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被細(xì)胞攝取。應(yīng)用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可區(qū)分和壞死細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)DNA出現(xiàn)Hoechest 3342標(biāo)記而不出現(xiàn)PI標(biāo)記的為凋亡細(xì)胞。
細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法在腫瘤研究中的應(yīng)用
檢測(cè)方法：獲取11×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，先用PI染色，再行Hoechest3342染色，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析或熒光顯微鏡觀察。PI及Hoechest3342均使用340nm紫外線激發(fā)，前者熒光為紅色（620nm）,后者熒光為藍(lán)色（480nm）。正常細(xì)胞藍(lán)色zui強(qiáng)。早期凋亡細(xì)胞由于DNA的漏出藍(lán)色稍弱并有少量的紅色熒光，晚期凋亡細(xì)胞紅色熒光加強(qiáng)。壞死細(xì)胞紅色熒光zui強(qiáng)。
膜聯(lián)蛋白（annexin）V標(biāo)記
正常細(xì)胞的細(xì)胞膜磷脂分布是不對(duì)稱(chēng)的，磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine,PS）位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞凋亡時(shí)轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜外表面，這一改變被認(rèn)為是特導(dǎo)性的，并且可作為凋亡細(xì)胞表面改變的標(biāo)記。PS表面化發(fā)生于凋早期，其機(jī)制尚不清，可能是一種導(dǎo)致機(jī)體吞噬凋亡細(xì)胞的信號(hào)。膜聯(lián)蛋白V是Ca2+依賴(lài)的磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)PS具有高度親和力，熒光標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V與細(xì)胞表現(xiàn)PS結(jié)合，再用顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，可以觀察凋亡過(guò)程中細(xì)胞膜PS的表面化。結(jié)合PI染色進(jìn)行雙參數(shù)檢測(cè)尚能區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞。正常細(xì)胞膜聯(lián)蛋白V（-）PI（-），早期凋亡細(xì)胞膜聯(lián)蛋白V（+）PI（-），晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞膜聯(lián)蛋白V（+）PI（+）。有研究表明膜聯(lián)蛋白V標(biāo)記僅有不到三分之一的凋亡細(xì)胞出現(xiàn)陽(yáng)性標(biāo)記，其原因尚不明。同時(shí)需注意度的是凋亡后期溶解階段，細(xì)胞碎片也可出現(xiàn)明顯的陽(yáng)性著色。
檢測(cè)方法：1×106細(xì)胞/ml細(xì)胞懸液，先后用膜聯(lián)蛋白V--FITC及PI染色，流式細(xì)胞儀分析，獲得由四個(gè)象限組成的細(xì)胞直方圖（cytogram），每個(gè)象限的細(xì)胞數(shù)目就是在檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)在所點(diǎn)的組份。左下象限代表正常細(xì)胞（An-PI-）,右下象限代表早期凋亡細(xì)胞（An+PI-），右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞（An+PI+）,左上象限代表細(xì)胞收集過(guò)程中出現(xiàn)的損傷細(xì)胞（An-PI+）。用生物素標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V還可以作體內(nèi)試驗(yàn)。將生物素標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V注射小鼠體內(nèi)，30分鐘后處死，迅速取出要研究的組織置于甲醛內(nèi)固定，然后，常規(guī)石蠟切片，脫蠟、水化，用親和素標(biāo)記的過(guò)氧化物酶程程序孵育，DAB顯色，光鏡下觀察凋亡細(xì)胞。
DNA瓊脂凝膠電泳法
細(xì)胞凋亡時(shí)，在內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的作用下，DNA在核小體間被切割成180-200bp整數(shù)倍的單或寡核苷酸片段，在電泳時(shí)表現(xiàn)為特征性的“梯形帶”。自Wyllie把內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶降解產(chǎn)生“梯形帶”與細(xì)胞凋亡相以來(lái)，“梯形帶”被作為細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要的生化指標(biāo)。盡管有報(bào)道指出，實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)典型的形態(tài)改變時(shí)可不伴有核小體間的DNA降解，對(duì)這一指標(biāo)提出質(zhì)疑，本方法仍被廣泛應(yīng)用。但此方法敏感性不高，大量凋亡細(xì)胞同時(shí)存在時(shí)才出現(xiàn)典型的結(jié)果，且只能被用于細(xì)胞群體，不能用于組織的原位檢測(cè)。
檢測(cè)方法：培養(yǎng)細(xì)胞清洗、離心，加入細(xì)胞裂解液裂解，高速離心，取上清液用酚/氯仿抽提二次，RNA酶消化，然后加到含溴已錠的1％-2％的瓊脂糖凝膠的樣品的孔中進(jìn)行電泳，zui后在紫外線燈下觀察和攝影。
DNA裂解的原位檢測(cè)
在細(xì)胞水平檢測(cè)DNA裂解的原位標(biāo)記技術(shù)已越來(lái)越多地被用于組織切片和培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞凋亡時(shí)，由于DNA的裂解，形成單或寡核小體的雙鏈相對(duì)分子質(zhì)量小的片段及在相對(duì)分子質(zhì)量大的DNA上形成單的繼裂（缺口，nick）。此類(lèi)斷裂可用生物素、地高辛或熒光素標(biāo)記的核苷酸在3`-OH端予以顯示。通常采用的酶是DNA聚合酶I或未端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT），前者使核苷酸結(jié)合于缺口，需要模板存在，標(biāo)記方法通常被稱(chēng)為“原位缺口平移”（insitu nick translation,ISNT）,后者使核苷酸在雙鏈的斷端延伸，不需要模板的存在，其方法被稱(chēng)為未端記（end labeling）、加尾法（tailing reaction）或TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）。上述方法，尤其是TUNEL的應(yīng)用已很廣泛，其優(yōu)點(diǎn)是可用于原位標(biāo)記，可用于病理組織，并可進(jìn)行定量分析。值得注意的是壞死期由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶和蛋白質(zhì)酶的何等用，DNA被切割成大小不等的片段，也可出現(xiàn) 陽(yáng)性反應(yīng)。組織或細(xì)胞外理不當(dāng)時(shí)可出現(xiàn)假陽(yáng)性。因而，TUNEL等方法對(duì)凋亡細(xì)胞的標(biāo)記是選擇性的。而不是特異性的，TUNEL或其他DNA裂解原位標(biāo)記的分析應(yīng)結(jié)合陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)，尤其是核的特征，細(xì)胞的分布和有無(wú)炎癥反應(yīng)，除外非凋亡的陽(yáng)性反應(yīng)。
檢測(cè)方法：石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，蛋白質(zhì)酶K消化，TdT酶和核苷酸混合液孵育，顯色（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記可用DAB顯色，堿性磷酸酶標(biāo)可用NBT+BCIP顯色），復(fù)染，脫水，封片。凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色（NBT+BCIP顯色）或者棕黃色（DAB顯色）。
凋亡蛋白質(zhì)酶（Caspase）-3及其底物的檢測(cè)
凋亡蛋白質(zhì)酶是一類(lèi)半胱氨酸蛋白質(zhì)酶，具有特異性水解底物分子天冬氨酸（Asp）殘七C端肽鍵功能，是近年隨著調(diào)亡研究的深入而發(fā)現(xiàn)的重要凋亡分子。迄今已有13個(gè)分子得到命名，分別為凋亡蛋白質(zhì)酶1-13?；械蛲龅鞍踪|(zhì)-3是被認(rèn)為在多種組織、細(xì)胞類(lèi)型中zui常涉及的凋亡效應(yīng)分子?；罨牡蛲龅鞍踪|(zhì)酶-3僅在凋亡細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，因此，檢測(cè)凋亡蛋白質(zhì)酶-3的活性有助于發(fā)現(xiàn)早期的凋亡細(xì)胞。一般采用人工合成四肽熒光底物如DEVD-AMC，凋亡蛋白質(zhì)酶-3在D與AMC之間水解，釋放熒光物質(zhì)、AMC，后者在紫外線激發(fā)下發(fā)出波長(zhǎng)為430-460nm的熒光，通過(guò)流式細(xì)胞儀或分光光度計(jì)對(duì)其強(qiáng)度進(jìn)行定量，從而測(cè)定凋亡蛋白質(zhì)酶-3的活性。由于醛對(duì)凋亡蛋白質(zhì)酶-3的水解活性抑制作用，因此同時(shí)加入含醛四肽如DEVD-CHO可以抑制凋亡蛋白質(zhì)酶-3對(duì)DEVD-AMC的水解，不產(chǎn)生熒光。這樣的抑制試驗(yàn)可作為對(duì)照，使凋亡蛋白質(zhì)酶-3的活性分析更有特異性。但是，上述方法不適用于組只切片，因此有人嘗試采用針對(duì)活化的凋亡蛋白質(zhì)酶-3亞基的抗體，通過(guò)免疫組化顯示凋亡細(xì)胞，然而其敏感性及特異性尚不能令人滿(mǎn)意。
檢測(cè)方法：培養(yǎng)細(xì)胞（也可以預(yù)先作凋亡誘導(dǎo)并在不同時(shí)段收集細(xì)胞）在裂解液內(nèi)裂解、離心、去上清液。加入凋亡蛋白質(zhì)酶-3的底物（如DEVD-AMC）孵育，同時(shí)用不加底物的樣品作對(duì)照，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，加有底物的樣品釋放出的熒光強(qiáng)度樣對(duì)照樣品明顯增強(qiáng)。如加入DEVD-AMC時(shí)再加入DEVD-CHO，樣品釋放的熒光強(qiáng)度與對(duì)照樣品無(wú)差異。
細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法在腫瘤研究中的應(yīng)用
凋亡蛋白質(zhì)酶-3導(dǎo)致細(xì)胞凋良心是通過(guò)水解或滅活一些細(xì)胞關(guān)鍵蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)的，因此檢測(cè)凋亡蛋白質(zhì)酶-3底物的改變也有助于辨認(rèn)細(xì)胞的凋亡。PARP是*個(gè)被認(rèn)識(shí)的凋亡蛋白質(zhì)酶-3底物，它的相對(duì)分子質(zhì)量為116000，水解后形成相對(duì)分子質(zhì)量為85000及相對(duì)分子質(zhì)量為25000的兩個(gè)片段，用運(yùn)載相對(duì)分子質(zhì)量為85000片段的抗體可以觀察細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。細(xì)胞骨架蛋白中的CK-18被凋亡蛋白質(zhì)酶-3水解后，在其C端的第387-396位氨基酸殘基形成一個(gè)新的抗原表位，用抗此表位的抗體可以在組織切片上辨認(rèn)凋亡細(xì)胞。另外一種細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)肌動(dòng)蛋白（actin）被水解后產(chǎn)生一種稱(chēng)為“fractin”的片段，在凋亡早期出現(xiàn)，并認(rèn)為與細(xì)胞膜的起泡有關(guān)，可能有助于早期凋亡細(xì)胞的辨認(rèn)?？傊S著對(duì)凋亡蛋白質(zhì)酶及其底物的進(jìn)一步研究，將會(huì)發(fā)現(xiàn)更有價(jià)值的有助于檢測(cè)凋亡細(xì)胞的方法。
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